Eeducir la limitación de oxígeno en cultivos microbianos de alta densidad requiere equilibrar la disponibilidad de oxígeno con la velocidad de crecimiento y la alimentación de sustrato .
En la Application Note Aerobic cultivation of high-oxygen-demanding microorganisms in the BioLector XT microbioreactor , Beckman Coulter Life Sciences investigó esta relación utilizando el microbiorreactor BioLector XT en cultivos de Escherichia coli y Vibrio natriegens , comparando diferentes estrategias de alimentación con aire atmosférico y aire enriquecido con oxígeno.
En procesos fed-batch , suministrar más glucosa sin garantizar una transferencia suficiente de O₂ puede provocar una disminución del oxígeno disuelto (OD) , reducir la tasa específica de crecimiento y favorecer cambios metabólicos y la formación de subproductos como acetato, lactato y etanol.
Sin embargo, aumentar la concentración de oxígeno tampoco constituye por sí solo una solución, ya que concentraciones elevadas de O₂ pueden favorecer la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) .
En cultivos de alta densidad, la alimentación de sustrato y la disponibilidad de oxígeno deben evaluarse de manera conjunta.
¿Por qué el oxígeno se convierte en un desafío en cultivos de alta densidad?
A medida que aumenta la biomasa, también aumenta la demanda metabólica de oxígeno. Si la transferencia de O₂ no logra acompañar el consumo celular, el oxígeno disuelto puede disminuir hasta alcanzar niveles críticos.
El impacto no se limita a una reducción del crecimiento. La limitación de oxígeno puede modificar el metabolismo celular y favorecer la formación de metabolitos no deseados. En E. coli , por ejemplo, la formación de acetato está asociada con el denominado metabolismo overflow.
Por esta razón, aumentar la alimentación de sustrato no significa necesariamente mejorar el rendimiento del cultivo. Una mayor disponibilidad de glucosa y un crecimiento más rápido también pueden generar una mayor demanda de oxígeno.
Este desafío se vuelve especialmente evidente en microorganismos de crecimiento muy rápido.
Vibrio natriegens : crecimiento rápido y alta demanda de oxígeno
Vibrio natriegens es una bacteria Gram-negativa conocida por su crecimiento excepcionalmente rápido, con tiempos de generación reportados de apenas 9,4 minutos en condiciones óptimas . Esta característica convierte al microorganismo en una plataforma de interés para aplicaciones biotecnológicas, pero también está asociada con elevadas tasas de consumo de glucosa y oxígeno.
Un estudio anterior citado en la Application Note reportó cultivos fed-batch de alta densidad de V. natriegens con tasas de consumo de oxígeno de hasta 500 mmol·L⁻¹·h⁻¹ . En esas condiciones, se utilizó aire enriquecido con un 60% de oxígeno para mantener el OD al 40% de la saturación de aire.
Esto plantea una pregunta importante en el desarrollo de bioprocesos:
“
¿Cuánto sustrato puede suministrarse antes de que la demanda metabólica supere la capacidad de transferencia de oxígeno del cultivo?
¿Cómo se realizó el experimento?
Para investigar esta relación, los investigadores utilizaron el BioLector XT equipado con un módulo microfluídico y una Gen2 Microfluidic FlowerPlate.
La configuración permitió monitorear en tiempo real la biomasa, el pH y el OD, además de controlar la alimentación y la composición del gas. En esta Application Note, los experimentos compararon específicamente aire atmosférico con 21% de O₂ y aire enriquecido con hasta 50% de O₂ , ambos con un caudal fijo de 50 mL/min.
La Figura 2 muestra la configuración experimental. La placa contiene 32 pocillos de cultivo equipados con optodos para mediciones ópticas de pH y OD. Los reservorios están conectados a los pocillos mediante canales microfluídicos, lo que permite añadir soluciones de forma controlada durante el experimento.
¿Qué ocurrió con E. coli cuando el oxígeno se volvió limitante?
En los cultivos fed-batch de E. coli con una estrategia de alimentación constante, las diferencias entre las condiciones de oxigenación se hicieron evidentes poco después de comenzar la alimentación con glucosa.
Con aire atmosférico, la transferencia de oxígeno dejó de ser suficiente para satisfacer la demanda del cultivo, lo que provocó una limitación de O₂ durante el resto del experimento. En las condiciones evaluadas con enriquecimiento de oxígeno, el cultivo mantuvo el crecimiento exponencial durante más tiempo y alcanzó una mayor concentración de biomasa que el cultivo limitado por oxígeno.
En la Figura 3, el principal aspecto que debe observarse es la disminución del OD después del inicio de la alimentación y la diferencia entre los perfiles obtenidos con aire atmosférico y en condiciones enriquecidas con oxígeno.
El comportamiento del pH también cambió. El cultivo limitado por oxígeno requirió una mayor adición de NaOH y, aun así, el pH permaneció aproximadamente 0,1 unidades por debajo del setpoint. Los autores sugieren que una mayor formación de metabolitos secundarios, como el acetato asociado al metabolismo overflow, podría explicar esta acidificación.
La limitación de oxígeno afectó más que el crecimiento. Los resultados también indicaron un cambio en el comportamiento metabólico del cultivo.
Los investigadores repitieron la comparación utilizando un perfil de alimentación lineal creciente.
La Figura 4 muestra que el comportamiento general volvió a repetirse. En las condiciones evaluadas, los cultivos con aire atmosférico se volvieron limitados por oxígeno poco después de comenzar la alimentación, mientras que el enriquecimiento con O₂ evitó esta limitación durante el período analizado.
Estos resultados refuerzan que la tasa de alimentación y la disponibilidad de oxígeno son variables interdependientes durante el desarrollo de una estrategia de cultivo fed-batch.
¿Qué ocurre si el oxígeno disuelto controla la alimentación?
En el experimento con V. natriegens , los investigadores fueron más allá de una tasa fija de alimentación y utilizaron el propio OD como señal para controlar la adición de sustrato.
Para este experimento específico, el sistema se configuró para añadir 4 µL de solución de alimentación rica en glucosa cada vez que el OD estuviera por encima del 6% . El umbral del 6% fue definido para esta estrategia experimental específica y no debe interpretarse como un límite universal para otros cultivos.
La lógica de control es sencilla.
Cuando el OD supera el umbral definido, se añade la solución de alimentación. Una vez que la glucosa está disponible, el metabolismo aeróbico aumenta el consumo de oxígeno y el OD disminuye. Cuando el OD cae por debajo del umbral establecido, la alimentación se interrumpe. Después de que el sustrato se consume y el OD se recupera, puede activarse un nuevo evento de alimentación.
El oxígeno disuelto deja de ser únicamente una variable monitoreada y pasa a formar parte activa de la estrategia de control de la alimentación.
Más de 30 ciclos de alimentación controlados por OD
La Figura 5 muestra claramente la diferencia entre los cultivos de V. natriegens bajo las dos condiciones de oxigenación.
Con 50% de O₂, el enriquecimiento con oxígeno mantuvo el OD por encima del 6% durante aproximadamente 5,75 horas. El cultivo finalmente alcanzó una condición de limitación de oxígeno alrededor de las 6 horas, lo que provocó la interrupción de la alimentación hasta que el OD se recuperó.
A partir de ese momento, el mecanismo de control alternó entre alimentación y pausa según la disponibilidad de oxígeno.
Este ciclo se repitió más de 30 veces , lo que resultó en la adición de casi 200 µL de solución de alimentación rica en glucosa durante las 6,5 horas restantes del experimento. Ninguno de estos eventos individuales de alimentación produjo una depleción completa del oxígeno en la fase líquida.
En comparación con el aire atmosférico, el cultivo enriquecido con oxígeno recibió más de cinco veces la cantidad de solución de alimentación . Con aire atmosférico se produjeron períodos más prolongados de depleción completa de oxígeno después de los pulsos de alimentación, acompañados por un comportamiento más irregular de la biomasa y el pH.
Los autores interpretaron estas oscilaciones como indicios de cambios metabólicos, incluida la posible utilización temporal de ácidos producidos como metabolitos overflow. Dado que estos metabolitos no fueron cuantificados directamente en el experimento, esta interpretación debe considerarse una hipótesis basada en los perfiles observados de OD, pH y biomasa.
¿Más oxígeno significa necesariamente más biomasa?
No.
A pesar de recibir una cantidad considerablemente mayor de solución de alimentación, la concentración final de biomasa de V. natriegens fue bastante similar entre los dos cultivos fed-batch presentados.
Los autores sugieren que la formación relativamente baja de biomasa en condiciones enriquecidas con oxígeno podría indicar un menor rendimiento de conversión de glucosa en biomasa y, posiblemente, una mayor formación de productos o metabolitos overflow. Sin embargo, estos compuestos no fueron cuantificados directamente en el experimento.
Este resultado es importante porque demuestra que el enriquecimiento con oxígeno no se traduce automáticamente en una mayor biomasa o una mayor productividad .
El valor del control de oxígeno está en ampliar las condiciones de proceso que pueden investigarse y hacer que el cultivo sea más controlable, no simplemente en suministrar más O₂.
¿Qué significan estos resultados para el desarrollo de bioprocesos?
Estos experimentos muestran que el desarrollo de un proceso fed-batch debe considerar no solo cuánto sustrato se suministra, sino también cuánto sustrato puede metabolizar el microorganismo dentro de las condiciones disponibles de transferencia de oxígeno.
El monitoreo continuo de biomasa, pH y OD también permite utilizar estas señales para desarrollar estrategias de control de lazo cerrado ( closed-loop ), como se demostró mediante la alimentación activada por OD en el experimento con V. natriegens .
Esta combinación de capacidades es precisamente lo que el BioLector XT permitió explorar en este trabajo:
- cultivos paralelos a microescala,
- monitoreo online de los parámetros del cultivo,
- control microfluídico de la alimentación y
- ajuste de la composición del gas.
¿Cómo puede aplicarse este enfoque al desarrollo de bioprocesos?
La plataforma BioLector XT permite monitorear en tiempo real parámetros como biomasa, fluorescencia, pH y oxígeno disuelto, además de ofrecer opciones de control microfluídico de la alimentación y del pH, así como ajuste de la composición del gas.
Para los laboratorios que trabajan en el desarrollo y optimización de bioprocesos, este enfoque permite investigar a microescala cómo diferentes combinaciones de alimentación, oxigenación y parámetros de control influyen en el comportamiento del cultivo.
Innotec Latam , junto con Beckman Coulter Life Sciences , apoya a investigadores y equipos de bioprocesos interesados en evaluar el BioLector XT para estrategias de cultivo microbiano y desarrollo de procesos.
¿Le gustaría explorar cómo el control de la alimentación, el pH y el oxígeno disuelto puede aplicarse a sus cultivos? Contacte con Innotec Latam para conocer las posibilidades que ofrece el BioLector XT para el desarrollo de bioprocesos a microescala.
Preguntas frecuentes sobre oxigenación y cultivo fed-batch de microorganismos
1. ¿Qué causa la limitación de oxígeno en cultivos microbianos de alta densidad?
La limitación de oxígeno ocurre cuando la demanda metabólica de O₂ de las células supera la capacidad del sistema para transferir oxígeno al medio de cultivo. A medida que aumentan la concentración de biomasa y la velocidad de crecimiento, también puede aumentar el consumo de oxígeno. Por esta razón, la tasa de alimentación de sustrato y la disponibilidad de oxígeno deben evaluarse conjuntamente en cultivos de alta densidad.
2. ¿Cuál es la relación entre glucosa, oxígeno disuelto y metabolismo overflow en E. coli ?
En cultivos fed-batch de E. coli , aumentar la disponibilidad de glucosa puede incrementar la actividad metabólica y, en consecuencia, elevar la demanda de oxígeno. Cuando esta demanda supera la capacidad de transferencia de O₂ del sistema, se produce una limitación de oxígeno y pueden aparecer cambios metabólicos. En el estudio analizado, los autores asociaron la mayor acidificación observada en condiciones limitadas por oxígeno con una posible mayor formación de metabolitos secundarios, como el acetato relacionado con el metabolismo overflow.
3. ¿Qué es la alimentación controlada por oxígeno disuelto en un cultivo fed-batch?
Es una estrategia de control en la que el oxígeno disuelto (OD) se utiliza como señal para determinar cuándo debe añadirse el sustrato. En el experimento con Vibrio natriegens , se añadieron 4 µL de solución de alimentación rica en glucosa cada vez que el OD se encontraba por encima del 6%. Cuando el consumo metabólico hacía que el OD descendiera por debajo de ese umbral, la alimentación se interrumpía hasta que el nivel de oxígeno se recuperaba. El umbral del 6% fue específico de esta estrategia experimental y no debe considerarse un valor universal para otros cultivos.
4. ¿Por qué Vibrio natriegens presenta desafíos particulares relacionados con la oxigenación?
Vibrio natriegens es una bacteria de crecimiento excepcionalmente rápido y, por lo tanto, puede presentar una elevada demanda metabólica tanto de sustrato como de oxígeno. El artículo cita tiempos de generación reportados de 9,4 minutos en condiciones óptimas y un estudio anterior de cultivo fed-batch de alta densidad que alcanzó tasas de consumo de oxígeno de hasta 500 mmol·L⁻¹·h⁻¹. Estas características hacen especialmente importante equilibrar la alimentación y la capacidad de transferencia de oxígeno durante el desarrollo del proceso.
5. ¿Aumentar la concentración de oxígeno siempre incrementa la biomasa?
No. En el experimento con V. natriegens , el cultivo enriquecido con oxígeno recibió más de cinco veces la cantidad de solución de alimentación que la condición con aire atmosférico, pero la concentración final de biomasa fue bastante similar entre ambos cultivos. Los autores plantearon como posibilidad un menor rendimiento de conversión de glucosa en biomasa y una mayor formación de productos o metabolitos overflow, aunque estos compuestos no fueron cuantificados directamente. Por lo tanto, una mayor disponibilidad de oxígeno no debe interpretarse automáticamente como una mayor producción de biomasa.
6. ¿Qué parámetros deben monitorearse para controlar un cultivo fed-batch a microescala?
En el estudio analizado se monitorearon en tiempo real la biomasa, el pH y el oxígeno disuelto. El BioLector XT también permitió controlar la alimentación mediante microfluídica y modificar la composición del gas. La combinación de estas variables permitió evaluar cómo la alimentación y la oxigenación afectaban el comportamiento del cultivo y, en el experimento con V. natriegens , utilizar el propio OD como parte de una estrategia de control de lazo cerrado.
7. ¿Cómo puede utilizarse el BioLector XT para optimizar bioprocesos microbianos?
El BioLector XT permite realizar cultivos paralelos a microescala y monitorear en tiempo real parámetros como biomasa, fluorescencia, pH y oxígeno disuelto. La plataforma también ofrece opciones de control microfluídico de la alimentación y del pH, además del ajuste de la composición del gas. Estas capacidades permiten investigar diferentes combinaciones de alimentación, oxigenación y parámetros de control durante el desarrollo y la optimización de bioprocesos.
Lecturas recomendadas
- High-cell-density fed-batch cultivations of Vibrio natriegens - Ver el artículo en PubMed
- Avoiding acetate accumulation in Escherichia coli cultures using feedback control of glucose feeding - Ver el artículo en PubMed
- Control and regulation of acetate overflow in Escherichia coli - Leer el artículo completo