Reduzir a limitação de oxigênio em cultivos microbianos de alta densidade exige equilibrar a disponibilidade de oxigênio com a velocidade de crescimento e a alimentação de substrato .
Na Application Note Aerobic cultivation of high-oxygen-demanding microorganisms in the BioLector XT microbioreactor , a Beckman Coulter Life Sciences investigou essa relação utilizando o microbiorreator BioLector XT em cultivos de Escherichia coli e Vibrio natriegens , comparando diferentes estratégias de alimentação sob ar atmosférico e ar enriquecido com oxigênio.
Em processos fed-batch , fornecer mais glicose sem garantir transferência suficiente de O₂ pode provocar a queda do oxigênio dissolvido (DO) , reduzir a taxa específica de crescimento e favorecer alterações metabólicas e a formação de subprodutos como acetato, lactato e etanol.
No entanto, aumentar a concentração de oxigênio também não constitui, isoladamente, uma solução, já que concentrações elevadas de O₂ podem favorecer a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) .
Em cultivos de alta densidade, a alimentação de substrato e a disponibilidade de oxigênio precisam ser avaliadas em conjunto.
Por que o oxigênio se torna um desafio em cultivos de alta densidade?
À medida que a biomassa aumenta, cresce também a demanda metabólica por oxigênio. Se a transferência de O₂ não acompanhar o consumo celular, o oxigênio dissolvido pode cair para níveis críticos.
O impacto não se limita à redução do crescimento. A limitação de oxigênio pode alterar o metabolismo celular e favorecer a formação de metabólitos indesejados. Em E. coli , por exemplo, a formação de acetato está associada ao chamado metabolismo overflow.
Por isso, aumentar a alimentação de substrato não significa necessariamente melhorar o desempenho do cultivo. Uma maior disponibilidade de glicose e um crescimento mais rápido também podem resultar em maior demanda por oxigênio.
Esse desafio se torna particularmente evidente em microrganismos de crescimento muito rápido.
Vibrio natriegens : crescimento rápido e alta demanda por oxigênio
Vibrio natriegens é uma bactéria Gram-negativa conhecida por seu crescimento excepcionalmente rápido, com tempos de geração reportados de apenas 9,4 minutos em condições ideais . Essa característica torna o microrganismo uma plataforma de interesse para aplicações biotecnológicas, mas também está associada a elevadas taxas de consumo de glicose e oxigênio.
Um estudo anterior citado na Application Note reportou cultivos fed-batch de alta densidade de V. natriegens com taxas de consumo de oxigênio de até 500 mmol·L⁻¹·h⁻¹ . Nessas condições, foi utilizado ar enriquecido com 60% de oxigênio para manter o DO em 40% da saturação do ar.
Isso leva a uma questão importante no desenvolvimento de bioprocessos:
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Quanto substrato pode ser fornecido antes que a demanda metabólica ultrapasse a capacidade de transferência de oxigênio do cultivo?
Como o experimento foi realizado?
Para investigar essa relação, os pesquisadores utilizaram o BioLector XT equipado com um módulo microfluídico e uma Gen2 Microfluidic FlowerPlate.
A configuração permitiu monitorar em tempo real biomassa, pH e DO, além de controlar a alimentação e a composição gasosa. Nesta Application Note, os experimentos compararam especificamente ar atmosférico contendo 21% de O₂ com ar enriquecido com até 50% de O₂ , ambos com vazão fixa de 50 mL/min. ( Beckman Coulter )
A Figura 2 apresenta a configuração experimental. A placa contém 32 poços de cultivo equipados com optodos para medições ópticas de pH e DO. Os reservatórios são conectados aos poços por canais microfluídicos, permitindo a adição controlada de soluções ao longo do experimento.
O que aconteceu com E. coli quando o oxigênio se tornou limitante?
Nos cultivos fed-batch de E. coli com uma estratégia de alimentação constante, as diferenças entre as condições de oxigenação se tornaram evidentes pouco depois do início da alimentação com glicose.
Sob ar atmosférico, a transferência de oxigênio deixou de ser suficiente para atender à demanda do cultivo, resultando em limitação de O₂ durante o restante do experimento. Nas condições avaliadas com enriquecimento de oxigênio, o cultivo manteve o crescimento exponencial por mais tempo e atingiu uma concentração de biomassa maior que a do cultivo limitado por oxigênio.
Na Figura 3, o principal ponto a observar é a queda do DO após o início da alimentação e a diferença entre os perfis obtidos sob ar atmosférico e condições enriquecidas com oxigênio.
O comportamento do pH também mudou. O cultivo limitado por oxigênio exigiu maior adição de NaOH e, mesmo assim, o pH permaneceu aproximadamente 0,1 unidade abaixo do setpoint. Os autores sugerem que uma maior formação de metabólitos secundários, como acetato associado ao metabolismo overflow, poderia explicar essa acidificação.
A limitação de oxigênio afetou mais do que o crescimento. Os resultados também indicaram uma mudança no comportamento metabólico do cultivo.
Os pesquisadores repetiram a comparação utilizando um perfil de alimentação linear crescente.
A Figura 4 mostra que o comportamento geral se repetiu. Nas condições testadas, os cultivos sob ar atmosférico se tornaram limitados por oxigênio pouco depois do início da alimentação, enquanto o enriquecimento com O₂ evitou essa limitação durante o período analisado.
Esses resultados reforçam que a taxa de alimentação e a disponibilidade de oxigênio são variáveis interdependentes no desenvolvimento de uma estratégia de cultivo fed-batch.
E se o próprio oxigênio dissolvido controlar a alimentação?
No experimento com V. natriegens , os pesquisadores foram além de uma taxa fixa de alimentação e utilizaram o próprio DO como sinal para controlar a adição de substrato.
Para esse experimento específico, o sistema foi configurado para adicionar 4 µL de solução de alimentação rica em glicose sempre que o DO estivesse acima de 6% . O limite de 6% foi definido para essa estratégia experimental específica e não deve ser interpretado como um valor universal para outros cultivos.
A lógica de controle é simples.
Quando o DO ultrapassa o limite definido, a solução de alimentação é adicionada. Com a glicose disponível, o metabolismo aeróbio aumenta o consumo de oxigênio e o DO diminui. Quando o DO cai abaixo do limite estabelecido, a alimentação é interrompida. Após o consumo do substrato e a recuperação do DO, um novo evento de alimentação pode ser acionado.
O oxigênio dissolvido deixa de ser apenas uma variável monitorada e passa a participar ativamente da estratégia de controle da alimentação.
Mais de 30 ciclos de alimentação controlados pelo DO
A Figura 5 mostra claramente a diferença entre os cultivos de V. natriegens sob as duas condições de oxigenação.
Com 50% de O₂, o enriquecimento com oxigênio manteve o DO acima de 6% por aproximadamente 5,75 horas. O cultivo acabou atingindo uma condição de limitação de oxigênio por volta de 6 horas, fazendo com que a alimentação fosse interrompida até a recuperação do DO.
A partir desse momento, o mecanismo de controle passou a alternar entre alimentação e pausa de acordo com a disponibilidade de oxigênio.
Esse ciclo foi repetido mais de 30 vezes , resultando na adição de quase 200 µL de solução de alimentação rica em glicose durante as 6,5 horas restantes do experimento. Nenhum desses eventos individuais de alimentação provocou a depleção completa do oxigênio na fase líquida.
Em comparação com o ar atmosférico, o cultivo enriquecido com oxigênio recebeu mais de cinco vezes a quantidade de solução de alimentação . Sob ar atmosférico, ocorreram períodos mais longos de depleção completa de oxigênio após os pulsos de alimentação, acompanhados por um comportamento mais irregular da biomassa e do pH.
Os autores interpretaram essas oscilações como indícios de alterações metabólicas, incluindo a possível utilização temporária de ácidos produzidos como metabólitos overflow. Como esses metabólitos não foram diretamente quantificados no experimento, essa interpretação deve ser considerada uma hipótese baseada nos perfis observados de DO, pH e biomassa.
Mais oxigênio significa necessariamente mais biomassa?
Não.
Apesar de receber uma quantidade substancialmente maior de solução de alimentação, a concentração final de biomassa de V. natriegens foi bastante semelhante entre os dois cultivos fed-batch apresentados.
Os autores sugerem que a formação relativamente baixa de biomassa sob condições enriquecidas com oxigênio pode indicar menor rendimento de conversão de glicose em biomassa e, possivelmente, maior formação de produtos ou metabólitos overflow. No entanto, esses compostos não foram diretamente quantificados no experimento.
Esse resultado é importante porque demonstra que o enriquecimento com oxigênio não se traduz automaticamente em maior biomassa ou maior produtividade .
O valor do controle de oxigênio está em ampliar as condições de processo que podem ser investigadas e tornar o cultivo mais controlável, e não simplesmente em fornecer mais O₂.
O que esses resultados significam para o desenvolvimento de bioprocessos?
Esses experimentos mostram que o desenvolvimento de um processo fed-batch deve considerar não apenas quanto substrato é fornecido, mas também quanto desse substrato o microrganismo consegue metabolizar dentro das condições disponíveis de transferência de oxigênio.
O monitoramento contínuo de biomassa, pH e DO também permite utilizar esses sinais no desenvolvimento de estratégias de controle em malha fechada ( closed-loop ), como demonstrado pela alimentação acionada pelo DO no experimento com V. natriegens .
Essa combinação de recursos é justamente o que o BioLector XT permitiu explorar neste trabalho:
- cultivos paralelos em microescala,
- monitoramento online dos parâmetros do cultivo,
- controle microfluídico da alimentação e
- ajuste da composição gasosa.
Como essa abordagem pode ser aplicada ao desenvolvimento de bioprocessos?
A plataforma BioLector XT permite monitorar em tempo real parâmetros como biomassa, fluorescência, pH e oxigênio dissolvido, além de oferecer opções de controle microfluídico da alimentação e do pH e ajuste da composição gasosa.
Para laboratórios que trabalham com desenvolvimento e otimização de bioprocessos, essa abordagem permite investigar em microescala como diferentes combinações de alimentação, oxigenação e parâmetros de controle influenciam o comportamento do cultivo.
A Innotec Latam , em conjunto com a Beckman Coulter Life Sciences , apoia pesquisadores e equipes de bioprocessos interessados em avaliar o BioLector XT para estratégias de cultivo microbiano e desenvolvimento de processos.
Quer explorar como o controle da alimentação, do pH e do oxigênio dissolvido pode ser aplicado aos seus cultivos? Entre em contato com a Innotec Latam para conhecer as possibilidades do BioLector XT no desenvolvimento de bioprocessos em microescala.
Perguntas frequentes sobre oxigenação e cultivo fed-batch de microrganismos
1. O que causa limitação de oxigênio em cultivos microbianos de alta densidade?
A limitação de oxigênio ocorre quando a demanda metabólica das células por O₂ supera a capacidade do sistema de transferir oxigênio para o meio de cultivo. À medida que a concentração de biomassa e a velocidade de crescimento aumentam, o consumo de oxigênio também pode crescer. Por isso, a taxa de alimentação de substrato e a disponibilidade de oxigênio precisam ser avaliadas em conjunto em cultivos de alta densidade.
2. Qual é a relação entre glicose, oxigênio dissolvido e metabolismo overflow em E. coli ?
Em cultivos fed-batch de E. coli , aumentar a disponibilidade de glicose pode elevar a atividade metabólica e, consequentemente, aumentar a demanda por oxigênio. Quando essa demanda supera a capacidade de transferência de O₂ do sistema, ocorre limitação de oxigênio e podem surgir alterações metabólicas. No estudo apresentado, os autores associaram a maior acidificação observada sob condições limitadas por oxigênio à possível maior formação de metabólitos secundários, como acetato relacionado ao metabolismo overflow.
3. O que é alimentação controlada por oxigênio dissolvido em um cultivo fed-batch?
É uma estratégia de controle em que o oxigênio dissolvido (DO) é utilizado como sinal para determinar quando o substrato deve ser adicionado. No experimento com Vibrio natriegens , foram adicionados 4 µL de solução de alimentação rica em glicose sempre que o DO estava acima de 6%. Quando o consumo metabólico fazia o DO cair abaixo desse limite, a alimentação era interrompida até que o nível de oxigênio se recuperasse. O limite de 6% foi específico dessa estratégia experimental e não deve ser considerado um valor universal para outros cultivos.
4. Por que Vibrio natriegens apresenta desafios particulares relacionados à oxigenação?
Vibrio natriegens é uma bactéria de crescimento excepcionalmente rápido e, por isso, pode apresentar elevada demanda metabólica tanto por substrato quanto por oxigênio. O artigo cita tempos de geração reportados de 9,4 minutos em condições ideais e um estudo anterior de cultivo fed-batch de alta densidade que atingiu taxas de consumo de oxigênio de até 500 mmol·L⁻¹·h⁻¹. Essas características tornam especialmente importante equilibrar a alimentação e a capacidade de transferência de oxigênio durante o desenvolvimento do processo.
5. Aumentar a concentração de oxigênio sempre aumenta a biomassa?
Não. No experimento com V. natriegens , o cultivo enriquecido com oxigênio recebeu mais de cinco vezes a quantidade de solução de alimentação da condição sob ar atmosférico, mas a concentração final de biomassa foi bastante semelhante entre os dois cultivos. Os autores levantaram como possibilidade um menor rendimento de conversão de glicose em biomassa e maior formação de produtos ou metabólitos overflow, embora esses compostos não tenham sido diretamente quantificados. Portanto, maior disponibilidade de oxigênio não deve ser interpretada automaticamente como maior produção de biomassa.
6. Quais parâmetros devem ser monitorados para controlar um cultivo fed-batch em microescala?
No estudo apresentado, biomassa, pH e oxigênio dissolvido foram monitorados em tempo real. O BioLector XT também permitiu controlar a alimentação por microfluídica e modificar a composição gasosa. A combinação dessas variáveis possibilitou avaliar como alimentação e oxigenação afetavam o comportamento do cultivo e, no experimento com V. natriegens , utilizar o próprio DO como parte de uma estratégia de controle em malha fechada.
7. Como o BioLector XT pode ser utilizado para otimizar bioprocessos microbianos?
O BioLector XT permite realizar cultivos paralelos em microescala enquanto monitora parâmetros como biomassa, fluorescência, pH e oxigênio dissolvido em tempo real. A plataforma também oferece opções de controle microfluídico da alimentação e do pH, além do ajuste da composição gasosa. Esses recursos permitem investigar diferentes combinações de alimentação, oxigenação e parâmetros de controle durante o desenvolvimento e a otimização de bioprocessos.
Leituras recomendadas
- High-cell-density fed-batch cultivations of Vibrio natriegens - Acessar o artigo no PubMed
- Avoiding acetate accumulation in Escherichia coli cultures using feedback control of glucose feeding - Acessar o artigo no PubMed
- Control and regulation of acetate overflow in Escherichia coli - Acessar o artigo completo