É possível reduzir o volume de amostra na análise de partículas por Light Obscuration?

Sim. É possível reduzir o volume de amostra no ensaio de partículas insolúveis por Light Obscuration de 5 mL para 1 mL sem impacto relevante na reprodutibilidade, e até 0,2 mL com resultados ainda viáveis, porém com maior variabilidade estatística.

Essa é a conclusão central de uma comparação interlaboratorial conduzida por pesquisadores japoneses e publicada na revista Biologicals , que avaliou padrões de poliestireno de 2, 5, 10 e 25 µm em seis laboratórios.

O tema não é apenas técnico. A Farmacopeia Americana já havia adotado, em 2014, um capítulo específico para partículas subvisíveis em injeções de proteínas terapêuticas, indicando a possibilidade de reduzir o volume de ensaio de 5 mL para 0,2 mL.

Faltava, porém, uma avaliação multilaboratorial do efeito dessa redução sobre exatidão e precisão. O estudo também serviu como uma das bases para a proposta de um novo teste geral de partículas insolúveis com volume reduzido na Farmacopeia Japonesa , colocada em consulta pública em 2017.

Neste artigo, você vai entender:

• o que é Light Obscuration e como o método funciona;
• por que o volume de 5 mL virou um problema para biofármacos;
• como o estudo interlaboratorial foi desenhado;
• o que aconteceu com a precisão em 1 mL e em 0,2 mL;
• por que o aumento da variabilidade não significa falha do método;
• por que as partículas de 25 µm se comportaram pior justamente no maior volume;
• quando a configuração do equipamento passa a interferir no resultado;
• o que o estudo permite e o que não permite concluir.

O que é Light Obscuration?

Light Obscuration é uma técnica de contagem e dimensionamento de partículas em suspensão baseada na interrupção de um feixe de luz. A amostra passa por uma célula óptica e, quando uma partícula atravessa o feixe, bloqueia parte da luz que chegaria ao detector.

A intensidade dessa redução é correlacionada ao tamanho da partícula. O número de eventos registrados permite estimar a concentração por volume analisado.

Na prática, o método fornece o número de partículas por mililitro, a distribuição por faixas de tamanho e as contagens em limites regulatórios específicos, como ≥10 µm e ≥25 µm.

Por isso, o Light Obscuration é o método prioritário no ensaio de partículas insolúveis em injetáveis, harmonizado entre as farmacopeias americana, europeia e japonesa.

O método tem uma condição de contorno importante: depende da passagem adequada da luz pela amostra. Emulsões, coloides e preparações lipossomais podem inviabilizar sua aplicação.

Por que reduzir o volume de amostra no ensaio de partículas insolúveis?

No procedimento farmacopéico tradicional, são exigidas quatro medições com no mínimo 5 mL cada. Esse desenho foi concebido em um cenário de injetáveis de maior volume.

O problema aparece com os produtos biológicos modernos. Injeções de proteínas terapêuticas envasadas em volumes baixos, geralmente abaixo de 1 mL, tornaram-se comuns porque a administração subcutânea pelo próprio paciente é preferida em doenças crônicas.

Segundo os autores, para produtos com quantidade rotulada inferior a 25 mL, pode ser necessário reunir o conteúdo de dez ou mais recipientes para atingir o volume exigido pelo ensaio.

Essa combinação traz consequências concretas:

• consumo elevado de um produto de alto valor agregado;
• aumento do custo do ensaio;
• mais manipulação e mais oportunidades de contaminação externa por partículas;
• perda da informação sobre a contagem de partículas em cada unidade individual.

Reduzir o volume, portanto, não é economia de amostra. É adequar o ensaio à realidade dos medicamentos que ele precisa controlar.

Como o estudo interlaboratorial foi conduzido?

O trabalho foi estruturado como uma comparação entre laboratórios para avaliar o efeito da redução do volume sobre a exatidão e a precisão da contagem por Light Obscuration.

Em vez de formulações reais, os pesquisadores utilizaram padrões de contagem de poliestireno rastreáveis ao NIST , com concentração nominal de 3000 partículas/mL ±10%. Todos os laboratórios trabalharam com os mesmos lotes.

Foram avaliados quatro diâmetros (2, 5, 10 e 25 µm) em três volumes de medição: 5 mL, 1 mL e 0,2 mL. Antes de cada teste, um volume de pré-corrida de 0,2 mL era passado pelo sistema. Cada teste incluía quatro medições, das quais as três últimas entravam no cálculo.

Um dos equipamentos utilizados em dois dos laboratórios foi o HIAC 9703 , disponível no catálogo da Innotec. Os instrumentos serviram como plataformas para investigar a pergunta central do trabalho, e não como objeto de comparação entre si.

Esse desenho define o alcance dos resultados: o estudo avaliou o desempenho analítico do método com padrões controlados, não a validação do procedimento em medicamentos biológicos reais.

O que acontece ao reduzir de 5 mL para 1 mL?

Esse é o resultado mais direto do trabalho. A precisão entre ensaios em 1 mL permaneceu praticamente equivalente à observada em 5 mL, em toda a faixa de 2 a 25 µm.

Os valores de desvio padrão relativo (RSD) entre ensaios foram:

Para 5 e 10 µm, a diferença entre 5 mL e 1 mL é praticamente irrelevante. Nos demais tamanhos, não houve deterioração acentuada.

Os autores acrescentam uma observação de peso prático: a variabilidade adicional introduzida pelo uso de 1 mL tende a ser menor do que a variabilidade entre equipamentos, entre laboratórios e a decorrente da própria manipulação da amostra.

Segundo o estudo, reduzir o volume de 5 mL para 1 mL tem pouco efeito sobre a reprodutibilidade do ensaio, e pode ser feito com os procedimentos de calibração já descritos nas farmacopeias vigentes.

E quando o volume cai para 0,2 mL?

Em 0,2 mL, o quadro muda de natureza. As contagens médias permaneceram dentro da faixa esperada de 3000 partículas/mL ±10%, e o RSD entre ensaios continuou abaixo de 5% para todos os tamanhos. Mas a dispersão aumentou de forma consistente.

O ponto decisivo do estudo é a explicação desse aumento. Ele não foi atribuído a perda de desempenho do equipamento, e sim à estatística de contagem.

Quando partículas estão distribuídas aleatoriamente, a contagem segue a distribuição de Poisson, na qual o desvio padrão equivale à raiz quadrada do número contado. Reduzindo o volume analisado, reduz-se o número absoluto de eventos contados, e a variação relativa cresce por consequência matemática.

Os autores compararam o desvio padrão observado dentro de cada ensaio com o valor previsto por Poisson:

Com exceção das partículas de 25 µm em 5 mL, os valores medidos acompanham de perto o previsto.

A maior dispersão em 0,2 mL é o comportamento estatístico esperado de contar menos partículas, não um sinal de que o método deixou de funcionar.

Isso não elimina a necessidade de cautela. Significa apenas que o resultado em volumes muito baixos precisa ser interpretado com essa dispersão em mente.

Por que as partículas de 25 µm exigiram atenção especial?

Aqui está o achado mais contraintuitivo do trabalho, e o que costuma ser invertido em leituras apressadas.

A variabilidade dentro do ensaio para partículas de 25 µm disparou justamente no maior volume. Em 5 mL, o desvio padrão das três medições chegou a 192, contra 71 em 1 mL e 140 em 0,2 mL. Além disso, a contagem da quarta fração vinha sistematicamente mais baixa que a da segunda e da terceira.

A explicação apontada pelos autores é a sedimentação. Aplicando a Lei de Stokes, uma partícula esférica de poliestireno de 25 µm com densidade de aproximadamente 1,05 g/cm³ sedimenta em água a cerca de 1 mm/s.

Parece pouco. Mas uma análise em 5 mL leva mais tempo do que uma análise em 1 mL. Quanto mais tempo transcorre após a homogeneização, mais partículas grandes deixam a região de amostragem.

Fatores que amplificam o efeito incluem:

• tempo decorrido desde a agitação;
• posição do tubo de amostragem no frasco;
• volume disponível no recipiente;
• duração total da sequência de medições.

Volume maior não é automaticamente mais seguro. Para partículas grandes, o ensaio mais longo pode ser justamente o mais suscetível à sedimentação.

A recomendação dos autores é analisar partículas dessa dimensão imediatamente após a homogeneização, ou com agitação durante a medição.

Quando a configuração do equipamento passa a influenciar o resultado?

Reduzir o volume não é alterar um parâmetro e repetir o mesmo procedimento. Com 0,2 mL, características físicas do sistema representam uma fração muito maior do volume total analisado.

Entram na conta o percurso da amostra, o volume morto, a exatidão do volume aspirado, a geometria interna e a configuração instrumental adotada.

O estudo trouxe um exemplo concreto. Dois laboratórios utilizavam o KL-04A equipado com compressing chamber . Na análise de partículas de 25 µm em 0,2 mL, a contagem caiu de forma acentuada. Os autores atribuíram o efeito ao percurso intermediário mais longo imposto por essa configuração — um laboratório removeu a câmara, o outro remediu sem ela, e os dados obtidos com a câmara foram excluídos da avaliação correspondente.

É desse episódio que nasce a principal ressalva do trabalho: abaixo de 1 mL, o desempenho do procedimento precisa ser verificado previamente em cada laboratório.

Entre os controles mencionados estão a exatidão do volume de amostra, a exatidão da contagem dentro da faixa especificada pela farmacopeia e a consistência entre as três medições utilizadas no ensaio.

O método funciona para partículas abaixo de 10 µm?

Dentro das condições avaliadas, sim. Os ensaios farmacopéicos tradicionais concentram atenção em ≥10 µm e ≥25 µm, limites definidos considerando o risco de oclusão capilar. O estudo ampliou a avaliação para padrões de 2 e 5 µm.

Os resultados levaram os autores a concluir que o Light Obscuration é viável para o monitoramento de partículas a partir de 2 µm.

Esse ponto tem contexto regulatório. Produtos proteicos podem conter, além de partículas externas e oriundas do processo produtivo, agregados da própria proteína ou complexos com outros componentes da formulação. Orientações regulatórias para avaliação de imunogenicidade recomendam o acompanhamento tanto da faixa ≥10 µm quanto da faixa de 2 a 10 µm ao longo do ciclo de vida do produto, sem indicar métodos específicos para as partículas menores.

Vale separar o que é justificativa do que é resultado experimental. O estudo não avaliou imunogenicidade nem demonstrou relação entre partículas de 2 a 10 µm e eventos adversos. Essa discussão aparece como motivação para ampliar a faixa monitorada.

O que o estudo permite concluir

Os achados podem ser resumidos de forma objetiva:

• 5 mL - condição de referência da comparação.
• 1 mL - precisão equivalente à de 5 mL; pouco efeito sobre a reprodutibilidade, com os procedimentos de calibração farmacopéicos atuais.
• 0,2 mL - resultados viáveis, RSD entre ensaios abaixo de 5%, com dispersão compatível com a estatística de Poisson e maior sensibilidade à configuração instrumental.
• Abaixo de 1 mL - o desempenho precisa ser verificado previamente por cada laboratório.
• Faixa avaliada - 2, 5, 10 e 25 µm, com padrões de poliestireno rastreáveis ao NIST.

Igualmente importante é o que o trabalho não sustenta. Ele utilizou padrões de contagem, e não medicamentos reais; não validou 0,2 mL para qualquer formulação; não comparou o desempenho entre as plataformas instrumentais utilizadas; e não avaliou imunogenicidade de agregados.

Seria incorreto ler o estudo como “0,2 mL é suficiente para analisar qualquer biofármaco por Light Obscuration”. A contribuição real é outra: o volume de 5 mL não representa um limite técnico absoluto, e a redução é viável desde que o sistema de medição seja compreendido e verificado.

Para laboratórios que trabalham com produtos de baixo volume e alto valor, a consequência prática é direta: menos amostra consumida, menos frascos combinados, preservação da informação por unidade individual e menos etapas de manipulação, que são, elas próprias, fontes de contaminação particulada.

Onde encontrar contadores de partículas

A Innotec representa na América Latina linhas de equipamentos para análise de sistemas particulados e bioprocessos, incluindo o HIAC 9703+ , contador e analisador de partículas em líquidos da Beckman Coulter, a mesma linhagem instrumental utilizada como plataforma no estudo interlaboratorial discutido neste artigo.

O catálogo reúne contadores de partículas para líquidos e para ar, analisadores de tamanho de partícula , analisadores de nanopartículas por NTA , contadores de células , biorreatores e analisadores de sorção de vapor , com filtros por norma aplicável e por indústria.

Para controle de partículas subvisíveis em injetáveis, o catálogo permite filtrar equipamentos diretamente pelas normas de referência, como USP <787> , USP <788> e EP 2.9.19 .

Conheça o HIAC 9703+ ou navegue pelo catálogo completo de equipamentos para pesquisa e laboratório.

Perguntas frequentes sobre Light Obscuration com volume reduzido

O que é o método Light Obscuration?

É uma técnica de contagem e dimensionamento de partículas em suspensão baseada na obstrução de um feixe de luz por partículas que atravessam uma célula óptica. A queda de intensidade luminosa é correlacionada ao tamanho da partícula.

Qual o volume mínimo de amostra em Light Obscuration segundo o estudo?

O estudo avaliou até 0,2 mL por medição e considerou os resultados viáveis nesse volume, com RSD entre ensaios abaixo de 5%. Para volumes inferiores a 1 mL, os autores recomendam verificação prévia do desempenho em cada laboratório.

Reduzir de 5 mL para 1 mL prejudica a reprodutibilidade?

Nos dados apresentados, não de forma relevante. A precisão entre ensaios permaneceu em níveis semelhantes em toda a faixa de 2 a 25 µm.

Por que a variabilidade aumenta em volumes menores?

Porque menos volume significa menos partículas contadas. Como a contagem segue a estatística de Poisson, a variação relativa cresce à medida que o número absoluto de eventos diminui.

Por que as partículas de 25 µm foram problemáticas?

Por sedimentação. Com velocidade de sedimentação da ordem de 1 mm/s, análises mais longas favorecem a queda das contagens ao longo das medições. O efeito foi mais evidente no volume de 5 mL.

O Light Obscuration serve para partículas abaixo de 10 µm?

O estudo indicou viabilidade para monitoramento de partículas a partir de 2 µm nas condições avaliadas, embora os limites farmacopéicos tradicionais se concentrem em ≥10 µm e ≥25 µm.

Quais equipamentos foram usados na comparação interlaboratorial?

Contadores de partículas por Light Obscuration KL-04A, da Rion, em quatro laboratórios, e HIAC 9703 em dois. Os instrumentos foram plataformas do estudo, sem comparação de desempenho entre eles.

O estudo substitui a validação do método para um produto específico?

Não. Os próprios autores afirmam que o desempenho de métodos com volume reduzido deve ser verificado para cada produto.

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