¿Es posible reducir el volumen de muestra en el análisis de partículas por Light Obscuration?

Sí. Es posible reducir el volumen de muestra en el ensayo de partículas insolubles por Light Obscuration de 5 mL a 1 mL sin un impacto relevante en la reproducibilidad, e incluso hasta 0,2 mL con resultados aún viables, aunque con una mayor variabilidad estadística.

Esta es la conclusión central de una comparación interlaboratorial realizada por investigadores japoneses y publicada en la revista Biologicals , que evaluó estándares de poliestireno de 2, 5, 10 y 25 µm en seis laboratorios.

El tema no es meramente técnico. La Farmacopea de los Estados Unidos (USP) ya había adoptado, en 2014, un capítulo específico para partículas subvisibles en inyecciones de proteínas terapéuticas, indicando la posibilidad de reducir el volumen de ensayo de 5 mL a 0,2 mL.

Sin embargo, faltaba una evaluación multilaboratorial del efecto de esta reducción sobre la exactitud y la precisión. El estudio también sirvió como una de las bases para la propuesta de un nuevo ensayo general de partículas insolubles con volumen reducido en la Farmacopea Japonesa (JP) , sometida a consulta pública en 2017.

En este artículo, usted comprenderá:

• qué es Light Obscuration y cómo funciona el método;
• por qué el volumen de 5 mL se convirtió en un problema para los biofármacos;
• cómo se diseñó el estudio interlaboratorial;
• qué ocurrió con la precisión a 1 mL y a 0,2 mL;
• por qué el aumento de la variabilidad no significa un fallo del método;
• por qué las partículas de 25 µm se comportaron peor precisamente en el volumen mayor;
• cuándo la configuración del equipo comienza a interferir en el resultado;
• qué permite y qué no permite concluir el estudio.

¿Qué es Light Obscuration?

Light Obscuration es una técnica de recuento y dimensionamiento de partículas en suspensión basada en la interrupción de un haz de luz. La muestra pasa a través de una celda óptica y, cuando una partícula atraviesa el haz, bloquea parte de la luz que llegaría al detector.

La intensidad de esta reducción se correlaciona con el tamaño de la partícula. El número de eventos registrados permite estimar la concentración por volumen analizado.

En la práctica, el método proporciona el número de partículas por mililitro, la distribución por intervalos de tamaño y los recuentos en límites reglamentarios específicos, como ≥10 µm y ≥25 µm.

Por ello, Light Obscuration es el método preferente en el ensayo de partículas insolubles en inyectables, armonizado entre las farmacopeas americana, europea y japonesa.

El método tiene una condición de contorno importante: depende del paso adecuado de la luz a través de la muestra. Las emulsiones, los coloides y las preparaciones liposomales pueden imposibilitar su aplicación.

¿Por qué reducir el volumen de muestra en el ensayo de partículas insolubles?

En el procedimiento farmacopeico tradicional, se requieren cuatro mediciones de al menos 5 mL cada una. Este diseño fue concebido en un escenario de inyectables de mayor volumen.

El problema surge con los productos biológicos modernos. Las inyecciones de proteínas terapéuticas envasadas en volúmenes bajos, generalmente inferiores a 1 mL, se han vuelto comunes porque la administración subcutánea por el propio paciente es preferida en enfermedades crónicas.

Según los autores, para productos con cantidad declarada inferior a 25 mL, puede ser necesario reunir el contenido de diez o más envases para alcanzar el volumen exigido por el ensayo.

Esta combinación trae consecuencias concretas:

• alto consumo de un producto de alto valor agregado;
• aumento del costo del ensayo;
• mayor manipulación y más oportunidades de contaminación externa por partículas;
• pérdida de la información sobre el recuento de partículas en cada unidad individual.

Reducir el volumen, por lo tanto, no es un ahorro de muestra. Es adecuar el ensayo a la realidad de los medicamentos que debe controlar.

¿Cómo se llevó a cabo el estudio interlaboratorial?

El trabajo se estructuró como una comparación entre laboratorios para evaluar el efecto de la reducción del volumen sobre la exactitud y la precisión del recuento por Light Obscuration.

En lugar de formulaciones reales, los investigadores utilizaron estándares de recuento de poliestireno trazables al NIST , con una concentración nominal de 3000 partículas/mL ±10%. Todos los laboratorios trabajaron con los mismos lotes.

Se evaluaron cuatro diámetros (2, 5, 10 y 25 µm) en tres volúmenes de medición: 5 mL, 1 mL y 0,2 mL. Antes de cada prueba, se hacía pasar un volumen de pre‑carrera de 0,2 mL por el sistema. Cada prueba incluía cuatro mediciones, de las cuales las tres últimas se utilizaban en el cálculo.

Uno de los equipos utilizados en dos de los laboratorios fue el HIAC 9703 , disponible en el catálogo de Innotec. Los instrumentos sirvieron como plataformas para investigar la pregunta central del trabajo, y no como objeto de comparación entre ellos.

Este diseño define el alcance de los resultados: el estudio evaluó el rendimiento analítico del método con estándares controlados, no la validación del procedimiento en medicamentos biológicos reales.

¿Qué ocurre al reducir de 5 mL a 1 mL?

Este es el resultado más directo del trabajo. La precisión entre ensayos a 1 mL se mantuvo prácticamente equivalente a la observada a 5 mL, en todo el rango de 2 a 25 µm.

Los valores de desviación estándar relativa (RSD) entre ensayos fueron:

Para 5 y 10 µm, la diferencia entre 5 mL y 1 mL es prácticamente irrelevante. En los demás tamaños, no hubo un deterioro acentuado.

Los autores añaden una observación de peso práctico: la variabilidad adicional introducida por el uso de 1 mL tiende a ser menor que la variabilidad entre equipos, entre laboratorios y la derivada de la propia manipulación de la muestra.

Según el estudio, reducir el volumen de 5 mL a 1 mL tiene poco efecto sobre la reproducibilidad del ensayo, y puede realizarse con los procedimientos de calibración ya descritos en las farmacopeas vigentes.

¿Y cuando el volumen cae a 0,2 mL?

A 0,2 mL, el panorama cambia de naturaleza. Los recuentos medios se mantuvieron dentro del rango esperado de 3000 partículas/mL ±10%, y el RSD entre ensayos siguió siendo inferior al 5% para todos los tamaños. Pero la dispersión aumentó de manera consistente.

El punto decisivo del estudio es la explicación de este aumento. No se atribuyó a una pérdida de rendimiento del equipo, sino a la estadística de recuento.

Cuando las partículas están distribuidas aleatoriamente, el recuento sigue la distribución de Poisson, en la que la desviación estándar equivale a la raíz cuadrada del número contado. Al reducir el volumen analizado, se reduce el número absoluto de eventos contados, y la variación relativa crece como consecuencia matemática.

Los autores compararon la desviación estándar observada dentro de cada ensayo con el valor previsto por Poisson:

Con excepción de las partículas de 25 µm a 5 mL, los valores medidos acompañan de cerca a los previstos.

La mayor dispersión a 0,2 mL es el comportamiento estadístico esperado al contar menos partículas, no una señal de que el método haya dejado de funcionar.

Esto no elimina la necesidad de precaución. Solo significa que el resultado en volúmenes muy bajos debe interpretarse teniendo en cuenta esta dispersión.

¿Por qué las partículas de 25 µm requirieron atención especial?

Este es el hallazgo más contraintuitivo del trabajo, y el que suele ser malinterpretado en lecturas apresuradas.

La variabilidad dentro del ensayo para partículas de 25 µm se disparó precisamente en el mayor volumen. A 5 mL, la desviación estándar de las tres mediciones alcanzó 192, frente a 71 a 1 mL y 140 a 0,2 mL. Además, el recuento de la cuarta fracción era sistemáticamente más bajo que el de la segunda y la tercera.

La explicación señalada por los autores es la sedimentación. Aplicando la Ley de Stokes, una partícula esférica de poliestireno de 25 µm con una densidad aproximada de 1,05 g/cm³ sedimenta en agua a unos 1 mm/s.

Parece poco. Pero un análisis a 5 mL lleva más tiempo que uno a 1 mL. Cuanto más tiempo transcurre después de la homogeneización, más partículas grandes abandonan la región de muestreo.

Los factores que amplifican el efecto incluyen:

• tiempo transcurrido desde la agitación;
• posición del tubo de muestreo en el frasco;
• volumen disponible en el recipiente;
• duración total de la secuencia de mediciones.

Un volumen mayor no es automáticamente más seguro. Para partículas grandes, el ensayo más largo puede ser precisamente el más susceptible a la sedimentación.

La recomendación de los autores es analizar las partículas de esta dimensión inmediatamente después de la homogeneización, o con agitación durante la medición.

¿Cuándo la configuración del equipo comienza a influir en el resultado?

Reducir el volumen no es cambiar un parámetro y repetir el mismo procedimiento. A 0,2 mL, las características físicas del sistema representan una fracción mucho mayor del volumen total analizado.

Entran en juego el recorrido de la muestra, el volumen muerto, la exactitud del volumen aspirado, la geometría interna y la configuración instrumental adoptada.

El estudio trajo un ejemplo concreto. Dos laboratorios utilizaban el KL-04A equipado con cámara de compresión . En el análisis de partículas de 25 µm a 0,2 mL, el recuento cayó de forma acentuada. Los autores atribuyeron el efecto al recorrido intermedio más largo impuesto por esta configuración, un laboratorio retiró la cámara, el otro remedió sin ella, y los datos obtenidos con la cámara fueron excluidos de la evaluación correspondiente.

Es de este episodio de donde surge la principal salvedad del trabajo: por debajo de 1 mL, el rendimiento del procedimiento debe ser verificado previamente en cada laboratorio.

Entre los controles mencionados se encuentran la exactitud del volumen de muestra, la exactitud del recuento dentro del rango especificado por la farmacopea y la consistencia entre las tres mediciones utilizadas en el ensayo.

¿El método funciona para partículas por debajo de 10 µm?

Dentro de las condiciones evaluadas, sí. Los ensayos farmacopeicos tradicionales concentran la atención en ≥10 µm y ≥25 µm, límites definidos considerando el riesgo de oclusión capilar. El estudio amplió la evaluación a estándares de 2 y 5 µm.

Los resultados llevaron a los autores a concluir que Light Obscuration es viable para el monitoreo de partículas a partir de 2 µm.

Este punto tiene contexto regulatorio. Los productos proteicos pueden contener, además de partículas externas y provenientes del proceso productivo, agregados de la propia proteína o complejos con otros componentes de la formulación. Las guías regulatorias para la evaluación de inmunogenicidad recomiendan el seguimiento tanto del rango ≥10 µm como del rango de 2 a 10 µm a lo largo del ciclo de vida del producto, sin indicar métodos específicos para las partículas más pequeñas.

Vale la pena separar lo que es justificación de lo que es resultado experimental. El estudio no evaluó inmunogenicidad ni demostró una relación entre partículas de 2 a 10 µm y eventos adversos. Esta discusión aparece como motivación para ampliar el rango monitoreado.

Lo que el estudio permite concluir

Los hallazgos pueden resumirse de forma objetiva:

• 5 mL - condición de referencia de la comparación.
• 1 mL - precisión equivalente a la de 5 mL; poco efecto sobre la reproducibilidad, con los procedimientos de calibración farmacopeicos actuales.
• 0,2 mL - resultados viables, RSD entre ensayos por debajo del 5%, con dispersión compatible con la estadística de Poisson y mayor sensibilidad a la configuración instrumental.
• Por debajo de 1 mL - el rendimiento debe ser verificado previamente por cada laboratorio.
• Rango evaluado - 2, 5, 10 y 25 µm, con estándares de poliestireno trazables al NIST.

Igualmente importante es lo que el trabajo no sustenta. Se utilizaron estándares de recuento, y no medicamentos reales; no se validó 0,2 mL para ninguna formulación; no se comparó el rendimiento entre las plataformas instrumentales utilizadas; y no se evaluó la inmunogenicidad de los agregados.

Sería incorrecto leer el estudio como “0,2 mL es suficiente para analizar cualquier biofármaco por Light Obscuration”. La contribución real es otra: el volumen de 5 mL no representa un límite técnico absoluto, y la reducción es viable siempre que el sistema de medición sea comprendido y verificado.

Para los laboratorios que trabajan con productos de bajo volumen y alto valor, la consecuencia práctica es directa: menos muestra consumida, menos frascos combinados, preservación de la información por unidad individual y menos pasos de manipulación, que son, por sí mismos, fuentes de contaminación particulada.

Dónde encontrar contadores de partículas

Innotec representa en América Latina líneas de equipos para análisis de sistemas particulados y bioprocesos, incluyendo el HIAC 9703+ , un contador y analizador de partículas en líquidos de Beckman Coulter, la misma línea instrumental utilizada como plataforma en el estudio interlaboratorial discutido en este artículo.

El catálogo reúne contadores de partículas para líquidos y para aire, analizadores de tamaño de partículas , analizadores de nanopartículas por NTA , contadores de células , biorreactores y analizadores de sorción de vapor , con filtros por norma aplicable y por industria.

Para el control de partículas subvisibles en inyectables, el catálogo permite filtrar equipos directamente por las normas de referencia, como USP <787> , USP <788> y EP 2.9.19 .

Conozca el HIAC 9703+ o navegue por el catálogo completo de equipos para investigación y laboratorio.

Preguntas frecuentes sobre Light Obscuration con volumen reducido

¿Qué es el método Light Obscuration?

Es una técnica de recuento y dimensionamiento de partículas en suspensión basada en la obstrucción de un haz de luz por partículas que atraviesan una celda óptica. La caída de intensidad luminosa se correlaciona con el tamaño de la partícula.

¿Cuál es el volumen mínimo de muestra en Light Obscuration según el estudio?

El estudio evaluó hasta 0,2 mL por medición y consideró los resultados viables en ese volumen, con RSD entre ensayos inferior al 5%. Para volúmenes inferiores a 1 mL, los autores recomiendan una verificación previa del rendimiento en cada laboratorio.

¿Reducir de 5 mL a 1 mL perjudica la reproducibilidad?

Según los datos presentados, no de forma relevante. La precisión entre ensayos se mantuvo en niveles similares en todo el rango de 2 a 25 µm.

¿Por qué aumenta la variabilidad en volúmenes menores?

Porque menos volumen significa menos partículas contadas. Como el recuento sigue la estadística de Poisson, la variación relativa crece a medida que disminuye el número absoluto de eventos.

¿Por qué las partículas de 25 µm fueron problemáticas?

Por sedimentación. Con una velocidad de sedimentación del orden de 1 mm/s, los análisis más largos favorecen la caída de los recuentos a lo largo de las mediciones. El efecto fue más evidente en el volumen de 5 mL.

¿Sirve Light Obscuration para partículas por debajo de 10 µm?

El estudio indicó viabilidad para el monitoreo de partículas a partir de 2 µm en las condiciones evaluadas, aunque los límites farmacopeicos tradicionales se centran en ≥10 µm y ≥25 µm.

¿Qué equipos se usaron en la comparación interlaboratorial?

Contadores de partículas por Light Obscuration KL-04A de Rion en cuatro laboratorios, y HIAC 9703 en dos. Los instrumentos fueron plataformas del estudio, sin comparación de rendimiento entre ellos.

¿El estudio sustituye la validación del método para un producto específico?

No. Los propios autores afirman que el rendimiento de los métodos con volumen reducido debe ser verificado para cada producto.

Lectura recomendada

• Partículas subvisibles en proteínas terapéuticas
• Ensayo de partículas insolubles en inyectables
• Contadores de partículas por obscurecimiento de luz