Obscurecimento de luz, contagem microscópica e os limites que se aplicam a cada volume
O que é a EP 2.9.19
A EP 2.9.19 é o capítulo geral da Farmacopeia Europeia dedicado à contaminação particulada por partículas subvisíveis em injetáveis e infusões.
A definição adotada no capítulo é precisa e delimita o escopo: contaminação particulada consiste em partículas estranhas, móveis e não dissolvidas, que não sejam bolhas de gás, presentes de forma não intencional nas soluções. Bolhas de gás não contam. Partículas dissolvidas não contam. O que se conta é matéria particulada indesejada e insolúvel.
Subvisível não significa irrelevante. Partículas abaixo do limiar de detecção visual podem indicar falha de filtração, degradação de componente de embalagem, incompatibilidade de formulação ou agregação proteica, todas com implicação clínica direta em produto parenteral.
Onde o ensaio se aplica
O capítulo cobre a maioria dos produtos parenterais de pequeno e grande volume, incluindo soluções prontas para uso por via intramuscular, subcutânea e intravenosa.
Além das soluções para diálise, a Farmacopeia Europeia exige o ensaio para:
- Preparações parenterais líquidas (monografia 0520).
- Água estéril para injetáveis (monografia 0169).
- Soluções para preservação de órgãos (monografia 1264).
Nem toda preparação parenteral pode ser examinada por um ou por ambos os métodos, e o próprio capítulo reconhece isso explicitamente.
Método 1: contagem por obscurecimento de luz
O Método 1 é o ensaio de contagem de partículas por obscurecimento de luz, e é o procedimento preferencial do capítulo.
O princípio é direto: a amostra passa por uma célula onde um feixe de luz é parcialmente obstruído por cada partícula. A magnitude da obstrução se correlaciona ao tamanho da partícula, e o número de eventos gera a contagem.
O procedimento clássico prevê remover quatro porções de não menos que 5 mL cada e contar as partículas iguais ou maiores que 10 µm e iguais ou maiores que 25 µm. O resultado da primeira porção é descartado, e calcula-se a média das demais.
Descartar a primeira porção não é detalhe burocrático: ela carrega o efeito de arraste do sistema e de manipulação inicial da amostra, e incluí-la distorceria o resultado para cima.
Método 2: contagem microscópica
O Método 2 é o ensaio de contagem microscópica de partículas. Usa microscópio binocular adequado, conjunto de filtração para reter a contaminação particulada e membrana filtrante, com auxílio de retículo de diâmetro circular para dimensionamento.
Ele entra em cena em duas situações distintas:
- Quando o Método 1 não é aplicável, por exemplo em preparações com clareza reduzida ou viscosidade aumentada.
- Quando o resultado do Método 1 excede os limites: nesse caso, a preparação é ensaiada pelo ensaio de contagem microscópica.
Esse segundo caso é frequentemente mal compreendido. Exceder o limite no Método 1 não é reprovação automática. É o gatilho para o Método 2, e a conclusão de conformidade pode exigir a execução sequencial dos dois procedimentos.
A razão técnica é conhecida: o obscurecimento de luz é sensível a bolhas de gás, a diferenças de índice de refração e a partículas translúcidas, o que pode gerar tanto falso positivo quanto subestimação. A contagem microscópica observa a partícula diretamente.
Preparo de amostra no Método 2
O capítulo detalha o preparo conforme o volume da unidade:
- Parenterais de grande volume: unidades individuais são ensaiadas.
- Parenterais de pequeno volume abaixo de 25 mL: o conteúdo de 10 ou mais unidades é combinado em recipiente limpo. Quando justificado e autorizado, a solução de ensaio pode ser preparada misturando o conteúdo de um número adequado de frascos e diluindo até 25 mL com água isenta de partículas R, ou com solvente apropriado sem contaminação de partículas quando a água isenta de partículas R não for adequada.
- Parenterais de pequeno volume com 25 mL ou mais: podem ser ensaiados individualmente.
A combinação de unidades tem consequência estatística que costuma passar despercebida: ela dilui o efeito de uma unidade fora de padrão, o que é adequado para o propósito do ensaio, mas não substitui investigação quando há suspeita de falha pontual de processo.
Limites e critérios de avaliação
A avaliação depende do volume nominal do recipiente:
- Para preparações fornecidas em recipientes com volume nominal maior que 100 mL, aplicam-se os critérios do ensaio 1.A.
- Para preparações fornecidas em recipientes com volume nominal menor que 100 mL, aplicam-se os critérios do ensaio 1.B.
- Para preparações fornecidas em recipientes com volume nominal de 100 mL, aplicam-se os critérios do ensaio 1.B.
O caso do volume nominal exatamente igual a 100 mL merece atenção, porque é onde ocorre boa parte dos erros de aplicação. Vale registrar que, para produtos parenterais de 100 mL nominais, a União Europeia considera aceitáveis os critérios de ensaio das três farmacopeias harmonizadas.
No ensaio 1.B, aplicável a recipientes de volume nominal menor ou igual a 100 mL, a preparação está conforme se o número médio de partículas nas unidades ensaiadas não exceder 3000 por recipiente para partículas iguais ou maiores que 10 µm, e não exceder 300 por recipiente para partículas iguais ou maiores que 25 µm.
Harmonização: EP 2.9.19, USP 788 e JP 6.07
Este capítulo passou por harmonização farmacopeica conduzida pelo Pharmacopoeial Discussion Group (PDG), e essa é uma das informações de maior valor prático para operações multinacionais.
Os textos equivalentes são:
- Ph. Eur. 2.9.19, Particulate Contamination: Sub-visible Particles.
- USP 788, Particulate Matter in Injections.
- JP 6.07, Insoluble Particulate Matter Test for Injections.
Segundo o Anexo 3(R1) da diretriz ICH Q4B, esses textos oficiais podem ser usados como intercambiáveis nas regiões ICH, sujeitos a uma condição: a calibração de instrumento e as medições de adequação do sistema devem seguir os requisitos regionais de boas práticas de fabricação.
Há, porém, uma ressalva registrada que operações que exportam aos Estados Unidos precisam conhecer: o FDA pode solicitar que a empresa demonstre que o método escolhido é aceitável e adequado para um material ou produto específico, independentemente da declaração de intercambiabilidade.
Revisão em curso pelo PDG
Uma versão revisada do capítulo 2.9.19 foi publicada no Pharmeuropa 33.2 e submetida a consulta pública. O texto resultou de discussões prolongadas entre especialistas da Farmacopeia Japonesa, da Farmacopeia Norte-Americana e da Farmacopeia Europeia dentro do PDG, com as três farmacopeias submetendo o texto atualizado a consulta pública em suas respectivas regiões.
Um ponto técnico relevante do texto revisado: o ensaio de contagem por obscurecimento de luz passa a permitir volumes de amostra menores que 5 mL, dependendo da capacidade do instrumento.
Essa mudança conversa diretamente com uma adaptação anterior. Na 165ª sessão da Comissão da Farmacopeia Europeia, em novembro de 2019, foram adotadas revisões que complementaram o texto harmonizado do PDG com requisitos locais alternativos aplicáveis a preparações parenterais biológicas.
A motivação é concreta: preparações biológicas são fornecidas em volumes baixos. Os requisitos locais, marcados no texto com losangos brancos, permitem ensaiar essas e outras preparações com volumes menores que 5 mL quando há instrumentação adequada disponível.
Partículas subvisíveis e partículas visíveis: capítulos distintos
A EP 2.9.19 trata de partículas subvisíveis. As partículas visíveis são tratadas em capítulo próprio, o 2.9.20.
Além dele, a Farmacopeia Europeia adotou o capítulo geral 5.17.2, não obrigatório, com recomendações sobre ensaio de contaminação particulada por partículas visíveis. Esse capítulo aborda:
- As diferentes fontes de contaminação por partículas estranhas em preparações líquidas.
- Os estágios de inspeção durante produção e controle de qualidade, incluindo estudo de estabilidade.
- Ensaio por nível de qualidade aceitável (AQL), com referência à norma ISO 2859-1, após inspeção de 100% do lote.
Um princípio relevante registrado nesse capítulo: a detecção de partículas visíveis em produtos parenterais é probabilística por natureza, e a ocorrência de partículas é aleatória. Isso significa que inspeção de 100% não equivale a garantia de ausência, e a estratégia de controle precisa considerar essa realidade estatística.
Implicações práticas para o laboratório
Executar a EP 2.9.19 de forma defensável em auditoria exige mais do que operar o contador de partículas. Os pontos que mais geram observação são:
- Calibração do instrumento com padrões rastreáveis e adequação do sistema conforme requisitos regionais de BPF.
- Controle do ambiente de ensaio, para evitar contribuição de partículas do próprio laboratório.
- Qualidade da água isenta de partículas usada em diluição e em branco.
- Técnica de desgaseificação e manuseio, para evitar contagem de bolhas como partículas.
- Registro do descarte da primeira porção e da média calculada.
- Procedimento definido para acionamento do Método 2 quando o Método 1 excede limites.
- Justificativa documentada quando se aplica requisito local de volume reduzido.
Para operações que envolvem caracterização e contagem de partículas, calibração e qualificação de equipamentos, esse conjunto define o escopo real de implantação do ensaio.