Oscurecimiento de luz, conteo microscópico y los límites que aplican a cada volumen
Qué es la EP 2.9.19
La EP 2.9.19 es el capítulo general de la Farmacopea Europea dedicado a la contaminación particulada por partículas subvisibles en inyectables e infusiones.
La definición adoptada en el capítulo es precisa y delimita el alcance: la contaminación particulada consiste en partículas extrañas, móviles y no disueltas, distintas de burbujas de gas, presentes de forma no intencional en las soluciones. Las burbujas de gas no cuentan. El material disuelto no cuenta. Lo que se cuenta es materia particulada indeseada e insoluble.
Subvisible no significa irrelevante. Las partículas por debajo del umbral de detección visual pueden indicar falla de filtración, degradación de componente de envase, incompatibilidad de formulación o agregación proteica, todas con implicación clínica directa en un producto parenteral.
Dónde aplica el ensayo
El capítulo cubre la mayoría de los productos parenterales de pequeño y gran volumen, incluidas las soluciones listas para uso por vía intramuscular, subcutánea e intravenosa.
Además de las soluciones para diálisis, la Farmacopea Europea exige el ensayo para:
- Preparaciones parenterales líquidas (monografía 0520).
- Agua estéril para inyectables (monografía 0169).
- Soluciones para preservación de órganos (monografía 1264).
No todas las preparaciones parenterales pueden examinarse por uno o ambos métodos, y el propio capítulo lo reconoce explícitamente.
Método 1: conteo por oscurecimiento de luz
El Método 1 es el ensayo de conteo de partículas por oscurecimiento de luz, y es el procedimiento preferente del capítulo.
El principio es directo: la muestra pasa por una celda donde un haz de luz es parcialmente obstruido por cada partícula. La magnitud de la obstrucción se correlaciona con el tamaño de la partícula, y el número de eventos genera el conteo.
El procedimiento clásico prevé retirar cuatro porciones de no menos de 5 mL cada una y contar las partículas iguales o mayores a 10 µm e iguales o mayores a 25 µm. El resultado de la primera porción se descarta, y se calcula la media de las restantes.
Descartar la primera porción no es un detalle burocrático: arrastra el efecto de residuo del sistema y de la manipulación inicial de la muestra, e incluirla sesgaría el resultado al alza.
Método 2: conteo microscópico
El Método 2 es el ensayo de conteo microscópico de partículas. Usa un microscopio binocular adecuado, un conjunto de filtración para retener la contaminación particulada y una membrana filtrante, con retículo de diámetro circular para el dimensionamiento.
Entra en juego en dos situaciones distintas:
- Cuando el Método 1 no es aplicable, por ejemplo en preparaciones con claridad reducida o viscosidad aumentada.
- Cuando el resultado del Método 1 excede los límites: en ese caso la preparación se ensaya por el conteo microscópico de partículas.
Ese segundo caso suele malinterpretarse. Exceder el límite en el Método 1 no es un rechazo automático. Es el disparador del Método 2, y llegar a una conclusión de conformidad puede exigir ejecutar ambos procedimientos en secuencia.
La razón técnica es conocida: el oscurecimiento de luz es sensible a burbujas de gas, a diferencias de índice de refracción y a partículas translúcidas, lo que puede producir tanto falsos positivos como subestimación. El conteo microscópico observa la partícula directamente.
Preparación de muestra en el Método 2
El capítulo detalla la preparación según el volumen de la unidad:
- Parenterales de gran volumen: se ensayan unidades individuales.
- Parenterales de pequeño volumen menores a 25 mL: el contenido de 10 o más unidades se combina en un recipiente limpio. Cuando esté justificado y autorizado, la solución de ensayo puede prepararse mezclando el contenido de un número adecuado de viales y diluyendo hasta 25 mL con agua exenta de partículas R, o con un solvente apropiado sin contaminación de partículas cuando el agua exenta de partículas R no sea adecuada.
- Parenterales de pequeño volumen de 25 mL o más: pueden ensayarse individualmente.
Combinar unidades tiene una consecuencia estadística que suele pasar desapercibida: diluye el efecto de una unidad fuera de patrón, lo cual es adecuado al propósito del ensayo, pero no sustituye la investigación cuando se sospecha una falla puntual de proceso.
Límites y criterios de evaluación
La evaluación depende del volumen nominal del recipiente:
- Para preparaciones suministradas en recipientes con volumen nominal mayor a 100 mL, aplican los criterios del ensayo 1.A.
- Para preparaciones suministradas en recipientes con volumen nominal menor a 100 mL, aplican los criterios del ensayo 1.B.
- Para preparaciones suministradas en recipientes con volumen nominal de 100 mL, aplican los criterios del ensayo 1.B.
El caso del volumen nominal exactamente igual a 100 mL merece atención, porque allí ocurre buena parte de los errores de aplicación. Cabe registrar que, para productos parenterales de 100 mL nominales, la Unión Europea considera aceptables los criterios de ensayo de las tres farmacopeas armonizadas.
En el ensayo 1.B, aplicable a recipientes de volumen nominal de 100 mL o menos, la preparación cumple si el número promedio de partículas en las unidades ensayadas no excede 3000 por recipiente para partículas iguales o mayores a 10 µm, y no excede 300 por recipiente para partículas iguales o mayores a 25 µm.
Armonización: EP 2.9.19, USP 788 y JP 6.07
Este capítulo pasó por armonización farmacopeica conducida por el Pharmacopoeial Discussion Group (PDG), y esa es una de las informaciones de mayor valor práctico para operaciones multinacionales.
Los textos equivalentes son:
- Ph. Eur. 2.9.19, Particulate Contamination: Sub-visible Particles.
- USP 788, Particulate Matter in Injections.
- JP 6.07, Insoluble Particulate Matter Test for Injections.
Según el Anexo 3(R1) de la directriz ICH Q4B, esos textos oficiales pueden usarse como intercambiables en las regiones ICH, sujetos a una condición: la calibración del instrumento y las mediciones de aptitud del sistema deben seguir los requisitos regionales de buenas prácticas de fabricación.
Hay, sin embargo, una salvedad registrada que las operaciones que exportan a Estados Unidos deben conocer: la FDA puede solicitar que la empresa demuestre que el método elegido es aceptable y adecuado para un material o producto específico, con independencia de la declaración de intercambiabilidad.
Revisión en curso por el PDG
Una versión revisada del capítulo 2.9.19 fue publicada en Pharmeuropa 33.2 y sometida a consulta pública. El texto resultó de discusiones prolongadas entre expertos de la Farmacopea Japonesa, la Farmacopea Estadounidense y la Farmacopea Europea dentro del PDG, con las tres farmacopeas sometiendo el texto actualizado a consulta pública en sus respectivas regiones.
Un punto técnico relevante del texto revisado: el ensayo de conteo por oscurecimiento de luz pasa a permitir volúmenes de muestra menores a 5 mL, según la capacidad del instrumento.
Ese cambio se conecta directamente con una adaptación anterior. En la 165ª sesión de la Comisión de la Farmacopea Europea, en noviembre de 2019, se adoptaron revisiones que complementaron el texto armonizado del PDG con requisitos locales alternativos aplicables a preparaciones parenterales biológicas.
La motivación es concreta: las preparaciones biológicas se suministran en volúmenes bajos. Los requisitos locales, marcados en el texto con rombos blancos, permiten ensayar esas y otras preparaciones con volúmenes menores a 5 mL cuando se dispone de instrumentación adecuada.
Partículas subvisibles y partículas visibles: capítulos distintos
La EP 2.9.19 trata partículas subvisibles. Las partículas visibles se tratan en un capítulo propio, el 2.9.20.
Junto a él, la Farmacopea Europea adoptó el capítulo general 5.17.2, no obligatorio, con recomendaciones sobre el ensayo de contaminación particulada por partículas visibles. Ese capítulo aborda:
- Las distintas fuentes de contaminación por partículas extrañas en preparaciones líquidas.
- Las etapas de inspección durante la producción y el control de calidad, incluido el estudio de estabilidad.
- El ensayo por nivel de calidad aceptable (AQL), con referencia a la norma ISO 2859-1, tras la inspección del 100% del lote.
Un principio relevante registrado en ese capítulo: la detección de partículas visibles en productos parenterales es probabilística por naturaleza, y la ocurrencia de partículas es aleatoria. Esto significa que la inspección del 100% no equivale a una garantía de ausencia, y la estrategia de control debe considerar esa realidad estadística.
Implicaciones prácticas para el laboratorio
Ejecutar la EP 2.9.19 de forma defendible en auditoría exige más que operar el contador de partículas. Los puntos que más generan observación son:
- Calibración del instrumento con patrones trazables y aptitud del sistema según los requisitos regionales de BPF.
- Control del ambiente de ensayo, para evitar la contribución de partículas del propio laboratorio.
- Calidad del agua exenta de partículas usada en dilución y en blanco.
- Técnica de desgasificación y manipulación, para evitar contar burbujas como partículas.
- Registro del descarte de la primera porción y de la media calculada.
- Procedimiento definido para activar el Método 2 cuando el Método 1 excede los límites.
- Justificación documentada cuando se aplica el requisito local de volumen reducido.
Para operaciones que involucran caracterización y conteo de partículas, calibración y calificación de equipos, ese conjunto define el alcance real de implantación del ensayo.