Las principales técnicas de extracción de exosomas son la ultracentrifugación diferencial y la precipitación mediante kits comerciales, y un estudio comparativo publicado en la revista científica PLOS ONE demostró que los tres kits probados (miRCURY, ExoQuick y TEIR) rindieron de 80 a 300 veces más partículas que la ultracentrifugación, manteniendo calidad equivalente.
En ese estudio, el instrumento ZetaView, basado en el análisis de rastreo de nanopartículas ( NTA ), fue la herramienta central utilizada para medir el tamaño, la concentración y el potencial zeta de los exosomas aislados.
El interés por las técnicas de extracción de exosomas ha crecido de forma acelerada en la última década, impulsado por el papel de estas vesículas como potenciales biomarcadores de enfermedades y transportadores de microARN.
Realizado por investigadores de la Augusta University en colaboración con la Duke University , el trabajo comparó cuatro métodos de aislamiento en diferentes volúmenes de suero humano: la ultracentrifugación diferencial y tres kits comerciales basados en precipitación. Se incluyeron volúmenes muy pequeños para simular la escasez común en muestras clínicas reales.
A continuación, los principales temas abordados en este contenido:
- Por qué aislar exosomas es un desafío técnico y científico;
- Los cuatro métodos de extracción comparados en el estudio;
- El papel del ZetaView y del análisis de rastreo de nanopartículas;
- Los métodos complementarios de caracterización;
- Los principales resultados de rendimiento, tamaño y potencial zeta;
- Lo que estos hallazgos significan en la práctica de laboratorio.
Por qué aislar exosomas es un desafío
Los exosomas son vesículas extracelulares esféricas, con un tamaño entre 40 y 150 nanómetros, derivadas del compartimento endosomal de las células. Transportan ADN genómico, ARN, proteínas y lípidos, actuando como mediadores de la comunicación entre células en organismos multicelulares.
Precisamente por transportar microARN y otras moléculas de señalización, los exosomas han ganado protagonismo como candidatos a biomarcadores de enfermedades y como potenciales sistemas de administración de fármacos. El problema es que aislarlos con calidad confiable y concentración suficiente sigue siendo considerado uno de los grandes desafíos científicos del área.
Identificar la técnica ideal de aislamiento es esencial para cualquier avance en el descubrimiento de nuevos biomarcadores basados en exosomas.
La dificultad radica en separar los exosomas de otros componentes del suero, como agregados de proteínas y lipoproteínas, sin alterar las propiedades físicas ni el contenido de las vesículas.
Es en este contexto que la elección del método de extracción se vuelve determinante para la validez de los resultados.
Los cuatro métodos de extracción de exosomas comparados
El estudio puso frente a frente cuatro métodos de aislamiento: la ultracentrifugación diferencial y tres kits comerciales, miRCURY, ExoQuick y TEIR. Aunque son cuatro métodos comparados, representan dos enfoques principales de aislamiento: ultracentrifugación y precipitación. La comparación fue diseñada para evaluar el método tradicional en relación con diferentes alternativas comerciales.
Ultracentrifugación diferencial (UC)
La ultracentrifugación diferencial es el método tradicional, adoptado durante décadas como referencia para aislar exosomas de fluidos biológicos. La técnica separa las partículas aplicando fuerzas centrífugas muy altas en ciclos sucesivos. A pesar de ser confiable, es laboriosa, lenta, sensible a la técnica del operador y requiere una ultracentrífuga, un equipo costoso y no siempre disponible.
Kits comerciales de precipitación
Los tres kits probados, miRCURY (Exiqon), ExoQuick (System Biosciences) y TEIR / Total Exosome Isolation Reagent (Life Technologies), se basan en la precipitación por exclusión de volumen, generalmente usando polietilenglicol (PEG). Por lo tanto, representan tres métodos comerciales distintos que utilizan el mismo enfoque general de aislamiento por precipitación. En comparación con la ultracentrifugación, son más rápidos, menos sensibles a la técnica, más compatibles con volúmenes limitados de muestra y no requieren equipos especiales.
Cómo el estudio diseñó la comparación
Para garantizar robustez, los investigadores extrajeron exosomas de seis volúmenes diferentes de suero humano combinado (5 mL, 1 mL, 500 μl, 250 μl, 100 μl y 50 μl) y confirmaron los resultados en seis muestras individuales de donantes. Los volúmenes más pequeños se incluyeron intencionalmente para simular la disponibilidad limitada de muestras biológicas heterogéneas en estudios clínicos.
El papel del ZetaView en el análisis de los exosomas
El ZetaView (Particle Metrix) fue el instrumento central de caracterización física del estudio. Utiliza la técnica de análisis de rastreo de nanopartículas, conocida por la sigla NTA (del inglés Nanoparticle Tracking Analysis ), empleada desde 2006 como un método confiable para medir el tamaño y la concentración de nanopartículas, incluyendo exosomas.
En la práctica, el equipo rastrea el movimiento browniano de nanopartículas individuales mediante un microscopio de video con dispersión de láser. A partir de este rastreo, el software calcula automáticamente las propiedades de cada muestra. El ZetaView es capaz de caracterizar partículas entre aproximadamente 10 y 2000 nanómetros.
Los tres parámetros medidos por el ZetaView
La relevancia del ZetaView en el estudio radica en consolidar tres mediciones esenciales en un único instrumento:
- Tamaño: el diámetro de las partículas más abundantes, utilizado para confirmar si se encuentran en el rango esperado de exosomas (40–150 nm);
- Concentración: el número total de partículas aisladas, convertido en valor absoluto a partir del volumen de resuspensión y los factores de dilución;
- Potencial zeta: la diferencia de potencial eléctrico entre la capa fija de la partícula cargada y los iones en solución, medida en milivoltios y utilizada como indicador de estabilidad.
Cuanto mayor es la magnitud del potencial zeta, mayor es la repulsión entre las partículas en solución, lo que sugiere una menor probabilidad de aglomeración o sedimentación. Este parámetro es, por lo tanto, un indicador directo de la estabilidad de las muestras aisladas.
Según los autores, este fue el primer estudio en integrar el potencial zeta y la cuantificación absoluta de microARN como parámetros de comparación entre métodos de aislamiento.
Métodos que complementaron la caracterización
Aunque el ZetaView fue el eje central, el estudio combinó varias técnicas complementarias para validar la identidad y la calidad de los exosomas aislados. Este enfoque múltiple fue uno de los diferenciales del trabajo.
- Microscopía electrónica de transmisión (TEM): confirmó la morfología clásica de los exosomas y, mediante inmunomarcación con oro, la presencia de los marcadores CD63 y CD9;
- Western blot: detectó la expresión de las proteínas CD63 y CD9 en todos los métodos de aislamiento;
- Agilent Bioanalyzer: evaluó la calidad y la cantidad del ARN exosomal;
- ddPCR (PCR digital en gotas): cuantificó de forma absoluta dos microARN conocidos, el miR-16 y el miR-451.
Principales resultados del estudio
La combinación de los análisis generó un conjunto consistente de resultados sobre el rendimiento de cada método de aislamiento. Los hallazgos aclaran tanto el rendimiento como la calidad de las partículas aisladas.
Rendimiento: los kits superaron a la ultracentrifugación
El hallazgo más significativo fue la diferencia de rendimiento. Los tres kits comerciales produjeron una cantidad significativamente mayor de exosomas que la ultracentrifugación en casi todos los volúmenes de suero. La UC aisló aproximadamente 79 a 126 veces menos partículas que los kits en los volúmenes de 50 μl a 1 mL.
En el volumen de 5 mL, la diferencia llegó a aproximadamente 299 veces, aunque no alcanzó significancia estadística debido a la gran variación entre las réplicas. Además, se observó una correlación lineal entre el volumen de suero y el número de partículas aisladas en todos los métodos.
Tamaño y morfología de las partículas
Todos los métodos aislaron partículas dentro del rango esperado de exosomas (40–150 nm). En el suero combinado, sin embargo, la ultracentrifugación produjo partículas con un diámetro significativamente mayor que los kits, un efecto atribuido a la posible fusión de las partículas con contaminantes bajo las altas velocidades de centrifugación.
Potencial zeta y estabilidad
Todas las mediciones de potencial zeta fueron negativas, variando de -9,8 a -22,6 mV a 23 °C. Estos valores indican que los exosomas aislados son partículas con carga negativa, en concordancia con estudios anteriores. La magnitud relativamente baja del potencial zeta apunta a cierta inestabilidad en solución.
La baja magnitud del potencial zeta refuerza la necesidad de precaución en el manejo y almacenamiento de los exosomas, que deben mantenerse a -80 °C.
Calidad y cantidad del ARN exosomal
Todo el ARN extraído presentó buena calidad, con un único pico entre 25 y 200 nucleótidos y sin señales de los picos ribosomales 18S o 28S. Curiosamente, a pesar de que los kits aislaron muchas más partículas, esto no se tradujo en una mayor cantidad de ARN: los métodos rindieron cantidades similares de ARN en la mayoría de los volúmenes.
En la cuantificación por ddPCR, todos los métodos detectaron los microARN miR-16 y miR-451, con una correlación lineal positiva entre el volumen de suero y la concentración de microARN. La variabilidad observada refuerza la importancia de mantener un mismo método de aislamiento a lo largo de un estudio.
Lo que estos hallazgos significan en la práctica
El conjunto de resultados respalda una conclusión clara y de aplicación directa en el laboratorio. Los tres kits comerciales, miRCURY, ExoQuick y TEIR, se mostraron como alternativas adecuadas a la ultracentrifugación, incluso con cantidades limitadas de material biológico.
En la práctica, esto significa que los laboratorios sin acceso a una ultracentrífuga, o que trabajan con muestras clínicas escasas, pueden recurrir a los kits sin comprometer la calidad del material aislado. La principal salvedad es la posible contaminación por lipoproteínas, una limitación común a prácticamente todos los métodos basados en precipitación.
Para sortear esta limitación, los autores recomiendan el uso consistente y repetido del mismo método dentro de un grupo de muestras investigadas, a fin de garantizar comparaciones válidas entre ellas.
Limitaciones a considerar
El propio estudio reconoce límites en su alcance. La comparación no cubrió todos los reactivos disponibles en el mercado, centrándose en tres de los kits más utilizados. Además, solo se probaron muestras de suero humano, lo que hace necesario replicar el análisis en otros fluidos, como orina, humor acuoso y líquido cefalorraquídeo.
Por último, no se evaluó la actividad biológica de los exosomas extraídos, un aspecto relevante para confirmar la relevancia clínica de las vesículas, que podría explorarse en estudios futuros.
Preguntas frecuentes sobre extracción de exosomas
¿Qué es un exosoma?
Es una vesícula extracelular de 40 a 150 nanómetros, derivada del compartimento endosomal de las células, que transporta ARN, ADN, proteínas y lípidos y actúa en la comunicación entre células.
¿Cuáles son las principales técnicas de extracción de exosomas?
Entre los enfoques evaluados en el estudio están la ultracentrifugación diferencial y la precipitación mediante kits comerciales. Se compararon cuatro métodos: ultracentrifugación, miRCURY, ExoQuick y TEIR.
¿Qué hace el ZetaView en un estudio de exosomas?
El ZetaView realiza el análisis de rastreo de nanopartículas (NTA), midiendo el tamaño, la concentración y el potencial zeta de las partículas aisladas.
¿Qué método de extracción rinde más exosomas?
En el estudio, los tres kits comerciales rindieron de 80 a 300 veces más partículas que la ultracentrifugación en la mayoría de los volúmenes de suero.
¿Qué es el potencial zeta?
Es la diferencia de potencial eléctrico entre la capa fija de una partícula cargada y los iones en solución, medida en milivoltios. Sirve como indicador de la estabilidad de las partículas.
¿Por qué los exosomas deben almacenarse a -80 °C?
Porque la baja magnitud del potencial zeta indica inestabilidad en solución, lo que exige precaución en el manejo y temperaturas de almacenamiento adecuadas para preservar las vesículas.
¿La ultracentrifugación sigue siendo útil para aislar exosomas?
Sí, sigue siendo un método de referencia, pero es más laboriosa, lenta y requiere equipos costosos. Los kits son alternativas viables, especialmente cuando hay poca muestra disponible.
¿Qué es la ddPCR en el análisis de exosomas?
Es la PCR digital en gotas, una técnica utilizada para cuantificar de forma absoluta microARN específicos, como el miR-16 y el miR-451, presentes en los exosomas aislados.
Lectura relacionada
- Vesículas extracelulares
- Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
- MicroARN como biomarcador
Fonte: DOI:10.1371/journal.pone.0170628